前言
本標(biāo)準(zhǔn)代替GB5009.5—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》、GB/T14889.2—2008《糧油檢驗(yàn)植物油料粗蛋白質(zhì)的測(cè)定》、GB/T15673—2009《食用菌中粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定》、GB/T5511—2008《谷物和豆類氮含量測(cè)定和粗蛋白質(zhì)含量計(jì)算凱氏法》、GB/T9695.11—2008《肉與肉制品氮含量測(cè)定》和GB/T9832—2008《糧油檢驗(yàn)植物油料餅粕含氮量的測(cè)定》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB5009.5—2010相比，
主要變化如下：——增加附錄A蛋白質(zhì)折算系數(shù)。
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)第一法和第二法適用于各種食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定，第三法適用于蛋白質(zhì)含量在10g/100g以上的糧食、豆類奶粉、米粉、蛋白質(zhì)粉等固體試樣的測(cè)定。
本標(biāo)準(zhǔn)不適用于添加無機(jī)含氮物質(zhì)、有機(jī)非蛋白質(zhì)含氮物質(zhì)的食品的測(cè)定。
第一法凱氏定氮法
2原理食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量計(jì)算氮含量，再乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。
3試劑和材料
3.1試劑
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水。
3.1.1硫酸銅（CuSO?·5H?O）。
3.1.2硫酸鉀（K?SO?）。
3.1.3硫酸（H?SO?）。
3.1.4硼酸（H?BO?）。
3.1.5甲基紅指示劑（C??H??N?O?）。
3.1.6溴甲酚綠指示劑（C??H??Br?O?S）。
3.1.7亞甲基藍(lán)指示劑（C??H??ClN?S·3H?O）。
3.1.8氫氧化鈉（NaOH）。
3.1.9 95%乙醇（C?H?OH）。
3.2試劑配制
3.2.1硼酸溶液（20g/L）：稱取20g硼酸，加水溶解后并稀釋至1000mL。
3.2.2氫氧化鈉溶液（400g/L）：稱取40g氫氧化鈉加水溶解后，放冷，并稀釋至100mL。
3.2.3硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c（1/2H?SO?）]0.0500mol/L或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c（HCl）]0.0500mol/L。
3.2.4甲基紅乙醇溶液（1g/L）：稱取0.1g甲基紅，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100mL。
3.2.5亞甲基藍(lán)乙醇溶液（1g/L）：稱取0.1g亞甲基藍(lán)，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100mL。
3.2.6 溴甲酚綠乙醇溶液（1 g/L）：稱取0.1 g溴甲酚綠，溶于95 %乙醇，用95 %乙醇稀釋至100 mL。
3.2.7 A混合指示液：2份甲基紅乙醇溶液與1份亞甲基藍(lán)乙醇溶液臨用時(shí)混合。
3.2.8 B混合指示液：1份甲基紅乙醇溶液與5份溴甲酚綠乙醇溶液臨用時(shí)混合。
4 儀器和設(shè)備
4.1 天平：感量為1 mg。
4.2 定氮蒸餾裝置：如圖1所示。
4.3 自動(dòng)凱氏定氮儀。
說明：
1——電爐；
2——水蒸氣發(fā)生器（2 L燒瓶）；
3——螺旋夾；
4——小玻杯及棒狀玻塞；
5——反應(yīng)室；
6——反應(yīng)室外層；
7——橡皮管及螺旋夾；
8——冷凝管；
9——蒸餾液接收瓶。
圖1 定氮蒸餾裝置圖
5 分析步驟
5.1 凱氏定氮法
5 分析步驟
5.1 凱氏定氮法
5.1.1 試樣處理：稱取充分混勻的固體試樣0.2 g～2 g、半固體試樣2 g～5 g或液體試樣10 g～25 g（約相當(dāng)于30 mg～40 mg氮），精確至0.001 g，移入干燥的100 mL、250 mL或500 mL定氮瓶中，加入0.4 g硫酸銅、6 g硫酸鉀及20 mL硫酸，輕搖后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。小心加熱，待內(nèi)容物全部碳化，泡沫完全停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶?jī)?nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色并澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5 h～1 h。取下放冷，小心加入20 mL水。放冷后，移入100 mL容量瓶中，并用少量水洗滌定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。
5.1.2 測(cè)定：按圖1裝好定氮蒸餾裝置，向水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水至2/3處，加入數(shù)粒玻璃珠，加甲基紅乙醇溶液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生器內(nèi)的水并保持沸騰。
5.1.3 向接收瓶?jī)?nèi)加入10.0 mL硼酸溶液及1滴～2滴混合指示液（B）并保持滿瓶，并使冷凝管的 下端插入液面下，根據(jù)試樣中氮含量，準(zhǔn)確吸取2.0 mL～10.0 mL試樣處理液由小玻杯注入反應(yīng)室，以10 mL水洗滌小玻杯并使之流入反應(yīng)室內(nèi)，隨后塞緊棒狀玻塞。將10.0 mL氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋緊，并加水封。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。蒸餾10 min 后移動(dòng)蒸餾液接收瓶，液面離開冷凝管下端，再蒸餾1 min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下蒸餾液接收瓶。以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至終點(diǎn)，如用A混合指示液，終點(diǎn)顏色為灰藍(lán)色；如用B混合指示液，終點(diǎn)顏色為淺紅色。同時(shí)做試劑空白。
5.2 自動(dòng)凱氏定氮儀法
稱取充分混勻的固體試樣0.2 g～2 g、半固體試樣2 g～5 g或液體試樣10 g～25 g（約相當(dāng)于30 mg～40 mg氮），精確至0.001 g，至消化管中，再加入0.4 g硫酸銅、6 g硫酸鉀及20 mL硫酸于消化爐進(jìn)行消化。當(dāng)消化爐溫度達(dá)到420℃后，繼續(xù)消化1 h，此時(shí)消化管中的液體呈綠色透明狀，取出冷卻后加入50 mL水，于自動(dòng)凱氏定氮儀（使用前加入氫氧化鈉溶液，鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液以及含有混合指示劑A或B的硼酸溶液）上實(shí)現(xiàn)自動(dòng)加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數(shù)據(jù)的過程。
6 分析結(jié)果的表述
試樣中蛋白質(zhì)的含量按式(1)計(jì)算：
式中：
X——試樣中蛋白質(zhì)的含量，單位為克每百克（g/100g）；
V?——試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為毫升（mL）；
V?——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為毫升（mL）；
c——硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，單位為摩爾每升（mol/L）；
0.0140——1.0 mL硫酸[c（\(\frac{1}{2}\)H?SO?） = 1.000 mol/L]或鹽酸[c（HCl） = 1.000 mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為克（g）；
m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；
V?——吸取消化液的體積，單位為毫升（mL）；
F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，各種食品中氮轉(zhuǎn)換系數(shù)見附錄A；
100——換算系數(shù)。
蛋白質(zhì)含量≥1 g/100 g時(shí)，結(jié)果保留三位有效數(shù)字；蛋白質(zhì)含量＜1 g/100 g時(shí)，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。
注：當(dāng)只檢測(cè)氮含量時(shí)，不需要乘蛋白質(zhì)換算系數(shù)F。
7 精密度
在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。
第二法 分光光度法
8 原理
食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，在pH 4.8的乙酸鈉 - 乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的 3,5 - 二乙酰 - 2,6 - 二甲基 - 1,4 - 二氫化吡啶化合物。在波長(zhǎng) 400 nm 下測(cè)定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。
9 試劑和材料
9.1 試劑
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的三級(jí)水。
9.1.1 硫酸銅（CuSO?·5H?O）。
9.1.2 硫酸鉀（K?SO?）。
9.1.3 硫酸（H?SO?）：優(yōu)級(jí)純。
9.1.4 氫氧化鈉（NaOH）。
9.1.5 對(duì)硝基苯酚（C?H?NO?）。
9.1.6 乙酸鈉（CH?COONa·3H?O）。
9.1.7 無水乙酸鈉（CH?COONa）。
9.1.8 乙酸（CH?COOH）：優(yōu)級(jí)純。
9.1.9 37%甲醛（HCHO）。
9.1.10 乙酰丙酮（C?H?O?）。9.2 試劑配制
9.2.1 氫氧化鈉溶液（300 g/L）：稱取30 g氫氧化鈉加水溶解后，放冷，并稀釋至100 mL。
9.2.2 對(duì)硝基苯酚指示劑溶液（1 g/L）：稱取0.1 g對(duì)硝基苯酚指示劑溶于20 mL 95 %乙醇中，加水稀釋至100 mL。
9.2.3 乙酸溶液（1 mol/L）：量取5.8 mL乙酸，加水稀釋至100 mL。
9.2.4 乙酸鈉溶液（1 mol/L）：稱取41 g無水乙酸鈉或68 g乙酸鈉，加水溶解稀釋至500 mL。
9.2.5 乙酸鈉 - 乙酸緩沖溶液：量取60 mL乙酸鈉溶液與40 mL乙酸溶液混合，該溶液pH 4.8。
9.2.6 顯色劑：15 mL甲醛與7.8 mL乙酰丙酮混合，加水稀釋至100 mL，劇烈振搖混勻（室溫下放置穩(wěn)定3d）。
9.2.7 氨氮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（以氮計(jì)）（1.0 g/L）：稱取105℃干燥2 h的硫酸銨0.472 0 g加水溶解后移于100 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，混勻，此溶液每毫升相當(dāng)于1.0 mg氮。
9.2.8 氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（0.1 g/L）：用移液管吸取10.00 mL氨氮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，加水定容至刻度，混勻，此溶液每毫升相當(dāng)于0.1 mg氮。
10 儀器和設(shè)備
10.1 分光光度計(jì)。
10.2 電熱恒溫水浴鍋：100℃±0.5℃。
10.3 10 mL具塞玻璃比色管。
10.4 天平：感量為1 mg。
11 分析步驟
11.1 試樣消解
稱取充分混勻的固體試樣0.1 g～0.5 g（精確至0.001 g）、半固體試樣0.2 g～1 g（精確至0.001 g）
或液體試樣1 g～5 g（精確至0.001 g），移入干燥的100 mL或250 mL定氮瓶中，加入0.1 g硫酸銅、1 g硫酸鉀及5 mL硫酸，搖勻后于瓶口放一小漏斗，將定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。緩慢加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶?jī)?nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5 h。取下放冷，慢慢加入20 mL水，放冷后移入50 mL或100 mL容量瓶中，并用少量水洗滌定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。按同一方法做試劑空白試驗(yàn)。
11.2 試樣溶液的制備
吸取2.00 mL～5.00 mL試樣或試劑空白消化液于50 mL或100 mL容量瓶?jī)?nèi)，加1滴～2滴對(duì)硝基苯酚指示劑溶液，搖勻后滴加氫氧化鈉溶液中和至黃色，再滴加乙酸溶液至溶液無色，用水稀釋至刻度，混勻。
11.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL和1.00 mL氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（相當(dāng)于0.00 μg、5.00 μg、10.0 μg、20.0 μg、40.0 μg、60.0 μg、80.0 μg和100.0 μg氮），分別置于10 mL比色管中。加4.00 mL乙酸鈉 - 乙酸緩沖溶液及4.00 mL顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于100℃水浴中加熱15 min。取出用水冷卻至室溫后，移入1 cm比色杯內(nèi)，以零管為參比，于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)量吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)各點(diǎn)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算線性回歸方程。
11.4 試樣測(cè)定
吸取0.50 mL～2.00 mL（約相當(dāng)于氮＜100 μg）試樣溶液和同量的試劑空白溶液，分別于10 mL比色管中。加4.0 mL乙酸鈉 - 乙酸緩沖液及4.0 mL顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于100℃水浴中加熱15 min。取出用水冷卻至室溫后，移入1 cm比色杯內(nèi)，以零管為參比，于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)量吸光度值，試樣吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量或代入線性回歸方程求出含量。
12 分析結(jié)果的表述
試樣中蛋白質(zhì)的含量按式(2)計(jì)算：
式中：
X——試樣中蛋白質(zhì)的含量，單位為克每百克（g/100g）；
C——試樣測(cè)定液中氮的含量，單位為微克（μg）；
C?——試劑空白測(cè)定液中氮的含量，單位為微克（μg）；
V?——試樣消化液定容體積，單位為毫升（mL）；
V?——試樣溶液總體積，單位為毫升（mL）；
m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；
V?——制備試樣溶液的消化液體積，單位為毫升（mL）；
V?——測(cè)定用試樣溶液體積，單位為毫升（mL）；
1000——換算系數(shù)；
100——換算系數(shù)；
F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。
蛋白質(zhì)含量≥1g/100g時(shí)，結(jié)果保留三位有效數(shù)字；蛋白質(zhì)含量＜1g/100g時(shí)，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。
13 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。
第三法 燃燒法
14 原理
試樣在900℃～1 200℃高溫下燃燒，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體，其中的碳、硫等干擾氣體和鹽類被吸收管吸收，氮氧化物被全部還原成氮?dú)?，形成的氮?dú)饬魍ㄟ^熱導(dǎo)檢測(cè)器（TCD）進(jìn)行檢測(cè)。
15 儀器和設(shè)備
15.1 氮/蛋白質(zhì)分析儀。
15.2 天平：感量為0.1 mg。
16 分析步驟
按照儀器說明書要求稱取0.1 g～1.0 g充分混勻的試樣（精確至0.000 1 g），用錫箔包裹后置于樣品盤上。試樣進(jìn)入燃燒反應(yīng)爐（900℃～1200℃）后，在高純氧（≥99.99%）中充分燃燒。燃燒爐中的產(chǎn)物（NO?）被載氣二氧化碳或氦氣運(yùn)送至還原爐（800℃）中，經(jīng)還原生成氮?dú)夂髾z測(cè)其含量。
17 分析結(jié)果的表述
試樣中蛋白質(zhì)的含量按式(3)計(jì)算：
式中：
X——試樣中蛋白質(zhì)的含量，單位為克每百克（g/100g）；
C——試樣中氮的含量，單位為克每百克（g/100g）；
F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。
結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
18 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。
19 其他
本方法第一法當(dāng)稱樣量為5.0 g時(shí)，檢出限為8 mg/100 g。
本方法第二法當(dāng)稱樣量為5.0 g時(shí)，檢出限為0.1 mg/100 g。
附 錄 A
常見食物中的氮折算成蛋白質(zhì)的折算系數(shù)
常見食物中的氮折算成蛋白質(zhì)的折算系數(shù)見表 A.1。
表A.1 蛋白質(zhì)折算系數(shù)表
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